完整细胞中磷酸二酯酶抑制的实时监测

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摘要

磷酸二酯酶(PDE)是水解酶,其将循环AMP(CAMP)和环状GMP(CGMP)转化为它们的相应单磷酸盐。 PDE-D ……

完整细胞中磷酸二酯酶抑制的实时监测

摘要磷酸二酯酶(pdes)是水解酶,其将循环amp(camp)和环状gmp(cgmp)转化为它们的循环amp(camp)和环状gmp(cgmp)相应的单磷酸盐。 PDE依赖性水解形状的这些第二信使细胞中的梯度,这可以形成它们的隔音沉积的基础,并在大量的生理和病理过程中发挥关键作用。

这里,我们提出了一种新的方法与特定PDE相关的当地营地和CGMP水平的实时监控。我们使用HEK 293细胞,表达编码融合到阵营和CGMP传感器的感兴趣的PDE(PDE3A,PDE4A1或PDE5A)的遗传构建体的HEK 293细胞,其允许直接可视化PDE分子附近的循环核苷酸浓度的变化通过荧光通存E谐振能量转移(FRET)。通过在96孔板上的单细胞成像来检测FRET,并显示PDE抑制剂对局部环核苷酸水平的特定作用。此外,该方法报告了PDE3A活性的生理调节,其通过CGMP的PKA依赖性磷酸化和抑制活化。

总之,我们的测定提供了一种独特敏感的方法,可分析活细胞中的PDE活性。它允许感测围绕特定PDE分子的CAMP梯度,并研究选择性抑制剂对局部阵营信号传导的药理作用。

关键词

PdeinhibiterCampcgmpfretview全文

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