上PDE5功能变构站点和催化现场配体效应与在酶的物理形式不同的变化相关

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天然磷酸二酯酶-5(PDE5)同型二聚体包含不同的非催化cGMP的变构位点和催化位点的cGMP水解。纯化再…

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上PDE5功能变构站点和催化现场配体效应与在酶的物理形式不同的变化相关

摘要

天然磷酸二酯酶-5(PDE5)同型二聚体包含不同的非催化cGMP的变构位点和催化位点的cGMP水解。纯化的重组PDE5通过预孵育的cGMP激活。相对低浓度的cGMP的产生从单个条带位置(较低频段),以具有降低的迁移率(上面的带)的带PDE5的非变性PAGE凝胶移位;的cGMP的浓度较高生产除了上频带中间迁移率(中间频带)的频带。两个点突变(G659A和G659P)催化位点附近的是减少cGMP底物的亲和力保持这样的WT PDE5的cGMP的变构结合亲和力但显示的cGMP诱导的凝胶移位只向中间带位置。上带库仑d表示通过cGMP结合到催化位点产生的形式,而中间带可以表示通过cGMP结合到变构位点产生的形式。毫摩尔的cGMP被要求对PDE5的凝胶移位时电泳过程中加入到预温育非变性PAGE之前,推测是由于除去大部分的cGMP的,但如果cGMP的包括在天然凝胶缓冲微摩尔的cGMP足以用于这种效果。 cGMP的诱导的凝胶移位用PDE5的催化活性的刺激相关联,并且开始和该效应可逆性的速率表明,这是由于cGMP结合到变构位点。与非水解,位点特异性催化PDE5的温育后,底物类似物,如抑制剂西地那非和他达那非,接着稀释,没有产生像与cGMP的获得催化活性的ctivation,虽然两者的抑制剂制造的类似凝胶移位到上频带作为与cGMP的获得。这隐含的催化位点的占领单独可产生凝胶移位到上频带。随后孵育至少1小时PDE5激活或凝胶迁移通过用稀释的cGMP降低反转。这种缓慢的可逆性会这样核苷酸的下降后PDE5延长细胞中的cGMP的影响。反转也被Mg ++除了预温育混合物来实现,以促进cGMP的降解,但Mg ++的除了没有扭转引起西地那非的凝胶移位,这是不通过PDE5水解。一旦稀释广泛的他达那非,一种有效的PDE5抑制剂的效果,以提高催化现场亲和力此INHIBI托尔被迅速扭转。因此,该催化位点的高亲和力PDE5抑制剂的结合动力学效果比通过cGMP结合到变构位点而获得更容易可逆。结论的cGMP或PDE5抑制剂结合于催化位点,或配体与催化位点和变构位点两者同时,改变PDE5到类似的物理形式;这种形式是从由cGMP结合到变构位点,这更慢激活酶和挫折产生不同。

缩写

PDEcyclic核苷酸phosphodiesteraseIBMX3异丁基-1- methylxanthineC domaincatalytic domainR domainregulatory domainPAGEpolyacrylamide凝胶electrophoresisKP10毫磷酸钾(pH6.8)中GAFc G MP结合PDE,鱼腥 A denylyl环化酶,例如大肠杆菌 F HLA蛋白

关键词

PhosphodiesterasePDEPDE5PDE5 inhibitorSildenafilTadalafilGAFCyclic GMPNegative feedbackAllosteric regulationView全文
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